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解決方案 | 測定寡核苷酸的消光系數(shù)（一）

瀏覽： 時間：2024-09-25


準(zhǔn)確測定藥品和藥品中的寡核苷酸的含量，對確保生產(chǎn)質(zhì)量和患者的安全至關(guān)重要。隨著目前反義和短干擾RNA（siRNA）治療的研究活動呈指數(shù)級增長，需要一種可靠的方法來準(zhǔn)確地定量給藥溶液。生產(chǎn)產(chǎn)品的規(guī)模從毫克到公斤不等。如果定量方法不準(zhǔn)確，除了由于劑量不正確而危及患者的安全外，還可能由于不準(zhǔn)確的產(chǎn)量信息而產(chǎn)生經(jīng)濟影響。由于寡核苷酸的吸濕性和靜電性質(zhì)，重量測量不適用于微量的樣品。測定寡核苷酸濃度的常規(guī)方法通常依賴于紫外吸收度的測量，這與分子的一個基本性質(zhì)有關(guān)。摩爾消光系數(shù)，也稱為摩爾吸收率ε，是一種測量化學(xué)物質(zhì)在給定波長下吸收光的強度。這是物質(zhì)的固有屬性；根據(jù)比爾-蘭伯定律，樣品的實際吸光度A取決于路徑長度l和物種的濃度C

A = εCl

寡核苷酸的摩爾消光系數(shù)是一種獨特的物理性質(zhì)，由其序列、溫度、pH值和其溶解的緩沖液或溶劑的性質(zhì)決定。雖然在最大值處的摩爾消光系數(shù)更準(zhǔn)確，一般來說，一個寡核苷酸的消光系數(shù)是在波長為260 nm，即ε260。光密度（OD）是核酸化學(xué)家使用的一個較古老的術(shù)語。光密度單位，或更常見的是OD，或者OD260，是寡核苷酸的吸光度測量。由于核酸鏈上的共軛雙鍵體系，核酸鏈中的每個堿基在260納米處或附近具有吸光度。因為確切的堿基序列和組成是已知的，OD260單位是一種非常準(zhǔn)確和方便的測量方法來定量寡核苷酸。OD260單位是一個歸一化的測量單位，定義為使用1.0 cm光程長度的比色皿在1.0 mL溶液中獲得260 nm處的吸光度值為1所需的寡核苷酸量。例如，考慮一個分子量為14303.6 g/mole的雙鏈siRNA，其摩爾消光系數(shù)為296843 M-1cm-1。使用A = εCl的關(guān)系，以及在1.0 mL溶液下的吸光度讀數(shù)為1.0，OD260相關(guān)內(nèi)容如下：

nmole/OD260 = (1/296843)*106= 3.4

μg/OD260 = 14303.6*(1/296843) = 48.2

組合化學(xué)方法的快速發(fā)展導(dǎo)致了大量適合治療使用的序列。這種活性需要快速計算消光系數(shù)和其他熱力學(xué)參數(shù)來設(shè)計寡核苷酸。由寡核苷酸生產(chǎn)商、大學(xué)和衛(wèi)生機構(gòu)開發(fā)的幾種基于網(wǎng)絡(luò)的計算器可供研究人員使用。本章將回顧消光系數(shù)的理論計算的來源，并為直接測定寡核苷酸的消光系數(shù)提供實驗細(xì)節(jié)。


計算ε260

采用Schneider方法測定哺乳動物組織和微生物中核酸的化學(xué)測定方法。用熱三氯乙酸（TCA）提取核酸。總核酸（TNA）通過測定提取物在260 nm處的吸光度和測定提取物的磷含量。用對硝基苯肼反應(yīng)測定DNA。采用紫外吸收法作為快速測定TNA的方法。三羧酸水解可以廣泛和重復(fù)地變性核酸。采用TCA水解和紫外吸收法分析組織和微生物中的TNA，并校正TCA吸收。已發(fā)表的單核苷酸和二核苷磷酸鹽的摩爾消光系數(shù)構(gòu)成了大多數(shù)現(xiàn)代合成寡核苷酸消光系數(shù)計算的基礎(chǔ)。寡核苷酸的消光系數(shù)通常可以用四種方法之一來計算。隨著復(fù)雜性的增加，它們是：

1. 無論堿基組成或序列如何，該方法假設(shè)單鏈寡核苷酸的標(biāo)稱濃度33 μg/mL，具有1個單位吸光度。該方法可以方便地用于計算寡核苷酸的粗產(chǎn)率。

2. 第二種方法假定寡核苷酸結(jié)構(gòu)中的所有核苷酸與溶液中的游離核苷酸具有相同或相似的摩爾消光系數(shù)。這種近似只有在寡核苷酸不具有任何二級結(jié)構(gòu)時才有用。總和是在單鏈中存在的所有類型的堿基上計算的。此外，在雙鏈核酸中所有類型的堿基對中，使用4個單核苷酸磷酸和可能的16個單磷酸二核苷的消光系數(shù)值進(jìn)行計算。利用表12.1給出的260 nm單核苷酸和二核苷磷酸公布的ε260值，計算9聚寡核苷酸GGC UCU UAG的ε260值如下圖所示：

eG + eG + eC + eU + eC + eU + eU + eA + eG

11500 + 11500 + 7200 + 9900 + 7200 + 9900 + 9900 + 15400 + 11500 = 94000 M-1cm-1

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3. 除了簡單的核苷酸消光系數(shù)總和外，建議將單個堿基的消光系數(shù)總和乘以系數(shù)0.9。這是由于單鏈中的堿基堆疊相互作用，相對于根據(jù)單個核苷酸消光系數(shù)計算出的值，會抑制DNA的吸光度。雙鏈的這種影響更大，自互補序列的倍增因子約為0.8。這些數(shù)字是對典型DNA 序列的估計。

4. 文獻(xiàn)中報道的分離核苷堿基的光吸收是在高稀釋的溶液中測量的。當(dāng)這些堿基與鄰近堿基相鄰時，它們會發(fā)生明顯的變化，從而在寡核苷酸中形成有序的二級結(jié)構(gòu)。在這種有序結(jié)構(gòu)中，堿基可以面對面堆疊，從而共享 π-π 電子相互作用，這對堿基的過渡偶極子產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。更重要的是，堿基堆疊會導(dǎo)致ε減小，即所謂的低色度。第四種方法考慮了堿基組成和序列順序，并對堆疊因子進(jìn)行了修正。這被認(rèn)為是基于最近鄰（第一鄰）模型的更精確方法。利用表12.1 中的值，用近鄰校正法計算9聚體 GGC UCU UAG 的ε260如下：

eGG + eGC + eCU +eUC + eCU + eUU + eUA + eAG - (eG + eC + eU + eC + eU + eU + eA)

21600 + 17400 + 2*16200 + 17200 + 19600 + 24600 + 25000 - (11500 + 7200 + 9900 + 7200 + 9900 + 9900 + 15400) = 86800 M-1cm-1


基于近鄰參數(shù)的計算可隨時預(yù)測寡核苷酸的熱力學(xué)性質(zhì)。DNA和RNA的單核苷酸和雙核苷酸的消光系數(shù)是在波長為260 nm、溫度為25°C、pH值為中性的水中測定的。


Richard Owczarzy等人開發(fā)了一套綜合生物信息學(xué)工具，用于預(yù)測原生核酸和化學(xué)修飾核酸的特性，并協(xié)助設(shè)計這些核酸。在線工具OligoAnalyzer 3.1具有計算單鏈DNA和RNA摩爾消光系數(shù)的功能。此外，還應(yīng)用最近鄰模型預(yù)測吸光度光譜，說明消光系數(shù)與波長的函數(shù)關(guān)系。還開發(fā)了另一種在線計算器，用于計算DNA和RNA（包括單鏈和雙鏈）的特性，包括分子量、溶液濃度、熔化溫度和估計吸光系數(shù)。


計算得出的消光系數(shù)與實驗得出的數(shù)值相差高達(dá)10-20%。這些差異可能是由于單核苷酸和二核苷酸磷酸鹽值所使用的數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，以及假定同源DNA和RNA單核苷酸的ε260值相同。Kallansrud和Ward報道的消光系數(shù)測定方法依賴于NaOH對RNA的水解。此外，DNA是用蛇毒磷酸二酯酶（SVP）或SVP/DNase I的混合物水解的。以水解為基礎(chǔ)的ε260 實驗測定依賴于寡核苷酸的完全水解和單體核苷酸消光系數(shù)的準(zhǔn)確性。此外，隨著目前合成寡核苷酸堿基修飾和共軛化學(xué)的進(jìn)步，這些寡核苷酸可能不易水解。而且，水解可能會導(dǎo)致未知途徑的降解。

Cavaluzzi和Borer通過1H-NMR確定核苷-5′-單磷酸的濃度，提高了消光系數(shù)的準(zhǔn)確性。Cavaluzzi-Borer對260 nm波長DNA堿基消光系數(shù)的校正已納入Integrated DNA Technologies (IDT) SciTools。


緩沖液的影響

寡核苷酸消光系數(shù)計算器得出的結(jié)果是基于溶解在pH值為7的水中的寡核苷酸的數(shù)據(jù)，離子強度可變，具體取決于選擇使用哪種計算器。根據(jù)實際經(jīng)驗，在水中進(jìn)行的測量并不準(zhǔn)確。圖12.1 展示了siRNA在水中、1xPBS中和0.9%生理鹽水中（濃度均為2 μM）的動力學(xué)實驗中測得的260 nm吸光度的變化。siRNA 在磷酸鹽緩沖液（PBS）和 0.9% 生理鹽水中的吸光度迅速達(dá)到平衡，并呈現(xiàn)恒定的吸光度讀數(shù)。然而，水溶液的吸光度在10分鐘內(nèi)隨著時間的推移持續(xù)上升，并沒有穩(wěn)定下來，這表明寡核苷酸在水介質(zhì)中沒有達(dá)到平衡。在控制良好的質(zhì)量控制（QC）實驗室中制備的寡核苷酸水溶液的吸光度重復(fù)測量的精確度，根據(jù)測量之間的間隔，會有1-2%以上的變化。如圖12.1所示，在鹽緩沖液中進(jìn)行的測量比在水中進(jìn)行的測量精確一個數(shù)量級。

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 圖12.1 吸光度隨時間變化的曲線圖：2 μM siRNA在水中的平均吸光度為0.6872，%RSD為0.90，2 μM siRNA在0.9%生理鹽水中的平均吸光度為0.5071，%RSD 為0.06，2 μM siRNA在1xPBS中的平均吸光度為0.4930，%RSD為0.06。所有測量均在25°C和260 nm波長下進(jìn)行。


水溶液中的siRNA雙鏈部分變性為有義鏈和反義鏈。由于這是一種動態(tài)平衡，總吸光度（雙鏈與單鏈之和）會隨著時間的推移而變化。圖12.1 中的吸光度隨時間變化的函數(shù)清楚地顯示了siRNA有序的原生結(jié)構(gòu)與無序的變性狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變，從而產(chǎn)生了高色度效應(yīng)。在生理鹽水或1xPBS溶液（最常用的腸外給藥溶液）中發(fā)現(xiàn)的鹽分存在時，siRNA的吸光度相對于其組成的單鏈?zhǔn)堑蜕摹Ｔ邴}溶液中重復(fù)測量吸光度將提供更多可重復(fù)的結(jié)果。由于消光系數(shù)的計算值與實驗值相差10-20%，建議在0.9%的生理鹽水中直接測定ε260。一般來說，使用0.9%的生理鹽水可為大多數(shù)RNA 雙鏈提供可靠的數(shù)據(jù)。

——節(jié)選自《Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products》