計算值與實驗值
在藥物發現階段，從互聯網工具中獲得的ε260 計算值是令人滿意的，因為在這一階段，最常見的是對各種寡核苷酸序列的活性進行排序，而沒有必要對寡核苷酸進行絕對定量。一旦寡核苷酸進入臨床前和臨床開發階段，準確確定配料溶液中的寡核苷酸濃度至關重要。藥物產品的 "標簽聲稱 "應通過可靠的分析方法確定，以符合預先確定的規格限制。關于計算值與實驗值 ε260 之間差異的影響說明如下。
這種合成的雙鏈 RNA 寡核苷酸是由兩條部分互補的單鏈 RNA 雜交而成。每條單鏈 RNA 都由 19 個核糖核苷酸和 3′端的兩個胸苷單位組成。其中一條鏈上的 19 個核糖核苷酸與另一條鏈上互補的 19 個核糖核苷酸雜交，從而形成 19 個核糖核苷酸對和雙鏈兩側的雙胸苷懸垂。有義鏈和反義鏈的組成如下：
Sense: 5′ - GGC UCU UAG CAA AGU CAA GTT - 3′
Antisense: 5′ - CUU GAC UUU GCU AAG AGC CTT - 3′
經實驗測定，有義鏈在水中的ε260為 183 100 (M-1cm-1)。使用 OligoAnalyzer 3.118 的計算值為 209700（M-1cm-1），比實驗測定值高 14.5%。使用 Ribotask 方法計算出的有義鏈計算值為 220,600 (M-1cm-1)，比實驗測定值高 20.5%。對于水中的反義鏈，實驗測定的 ε260 值為 168,300 (M-1cm-1)。
使用 OligoAnalyzer 3.118 對反義鏈的計算值為 197,800 (M-1cm-1)，比實驗測定值高 17.5%。使用 Ribotask 對反義鏈的計算值為 209,100 (M-1cm-1)，比實驗測定值高 24.2%。其他幾種網絡工具也可以對計算值和實驗值進行類似的比較。
上述比較清楚地表明了各種計算方法得出的計算值與直接測定值之間的差異。為了用單鏈構建雙鏈，必須確定單鏈的摩爾濃度，而且必須小心地制作已知摩爾比的混合物。如果根據不同網絡工具的計算值進行計算，可能會影響 siRNA 雙鏈的質量。此外，根據錯誤計算得出的藥物制劑最終濃度可能不準確，無法滿足標簽聲明的規格要求。
消光系數的直接測定
各種基于網絡的寡核苷酸計算器提高消光系數計算精度的迭代過程取決于單核苷酸磷酸酯消光系數的準確測定。然而，隨著用于 siRNA 治療的各種嵌合 DNA-RNA 序列迅速增加，在線計算器無法確定所有消光系數。即使是消光系數的近似估計值，與真實值相差 10-20%，也會對毒理學安全性數據的結論產生嚴重影響，并導致臨床用藥方案的計算錯誤。這種計算錯誤還會導致以公斤為單位合成寡核苷酸的產量結果不準確，也會導致成品成本大幅增加。
因此，建議直接測定將用于毒理學和臨床研究的前導序列的消光系數。如下所述，直接測定不依賴于單核苷酸二核苷酸磷酸鹽的單個消光系數值。不過，直接測定不需要對樣品進行長時間的水解；應合成最高純度的參考標準并用于ε260測定。
1. 實驗步驟
在濕度控制手套箱中稱取 20.0 ± 2.0 mg凍干寡核苷酸。定量轉移到 100 mL A 級容量瓶中，并溶解在 0.9%的生理鹽水中。在稱量樣品進行 ε260 測定時，必須同時測定水分含量（采用Karl-Fisher法）。樣品中過量的鹽分也會影響樣品重量。因此，建議在稱量樣品進行 ε260 測定的同時，稱量另一個樣品進行鈉分析。對稱量出的樣品進行水分校正。如果鈉含量沒有明顯高于鈉的理論值，則無需校正過量的鈉含量。計算該儲備溶液的濃度（約 0.2 mg/mL）。進行稀釋（n = 5），使校準標準的吸光度讀數介于 0.3 和 1.2 之間（見表 12.2 中的樣品稀釋方案）。將紫外儀器的溫度設置為 25°C。
至少 30 分鐘后，確認紫外儀器在 260 nm波長處的光度精度。對每種校準溶液進行一式三份的測量，并繪制平均讀數與校準標準濃度的對比圖。紫外吸光度與濃度的校準圖的即為 ε260 的值，單位為mole/L。一式三份進行上述ε260 的測定，取平均值得到ε260 的最終值。
2. 通過直接測量計算 ε260 的示例
稱取分子量為 14303.6 g/mole、含水量為 3.03% 的 siRNA 雙鏈體，一式三份，溶于 100 mL 0.9% 生理鹽水中。一式三份，溶解在 100 mL 0.9%生理鹽水中。
對于Replicate 1（見表 12.2），經濕度校正的樣品重量為
= 19.02*(100 - 3.03)/100 = 18.444 mg
= 18.444 mg*(g/1000 mg)*(1/100 mL)*(1000 mL/L)*(mole/14303.6 g)
= 1.29E-05 M
進行連續稀釋（n = 5），在 260 nm、25°C 和色度計比色皿路徑長度為 1.0 cm處測量吸光度，一式三份。第一份樣品 1 的原液稀釋為 5 mL 加入 100 mL。稀釋后溶液的濃度為
= (5/100)* 1.29E-05 = 6.45E-07
該溶液的平均吸光度測量值（n = 3）為 0.1945 AU。有關三個稱重重復的五個稀釋度的完整數據集，請參見表 12.2。根據數據的斜率計算出 siRNA 在 260 納米波長處的消光系數；每個重復品的五個測量值的校準圖見圖 12.2。三個重復品的斜率分別為 297,342、298,092、 295,095，摩爾消光系數的平均值為 296,843 M-1cm-1，相對標準偏差為 0.5%。
Fig 12.2 三份摩爾消光系數測定值的校準圖
總結
本章將幫助讀者評估是否需要通過實驗確定消光系數。本章舉例說明了各種計算值與實驗測定值之間的差異，還提供了直接測定 siRNA 寡核苷酸摩爾消光系數的詳細實驗步驟。
——節選自《Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products》
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